Ujian MTT – Kaedah Makmal untuk Menilai Kesan Bahan Terhadap Sel Hidup

Dalam dunia penyelidikan bioperubatan dan bioteknologi, pemahaman tentang bagaimana sesuatu bahan kimia, ubat, atau sebatian semula jadi mempengaruhi sel hidup merupakan aspek yang amat penting dan menjadi asas kepada banyak penemuan saintifik yang memberi impak yang besar. Sama ada dalam usaha mencari rawatan baharu bagi penyakit kanser, merintis produk kosmetik yang lebih selamat, ataupun menilai kesan toksik bahan kimia industri, penilaian terhadap kelangsungan hidup dan tindak balas sel merupakan langkah awal yang wajar diambil. Salah satu kaedah paling meluas digunakan untuk tujuan ini ialah ujian MTT, iaitu sejenis kaedah makmal yang membolehkan penyelidik menilai tahap kebolehhidupan sel selepas terdedah kepada sesuatu bahan (Nga et al., 2020).

Walaupun nama "MTT" mungkin kedengaran teknikal, ujian ini sebenarnya adalah prosedur yang mudah, cepat dan kos efektif, serta sangat sesuai untuk pelbagai jenis kajian, termasuk penyaringan awal keberkesanan ubat atau bahan aktif dalam ekstrak tumbuhan. Apa yang menjadikan ujian ini begitu penting ialah keupayaannya dalam memberikan gambaran kuantitatif sel dan menentukan sama ada sel masih hidup, atau telah terjejas selepas pendedahan kepada bahan uji. Ujian ini bertindak sebagai penapis awal yang membolehkan saintis menentukan sama ada sesuatu bahan itu berisiko toksik ataupun selamat digunakan dalam aplikasi selanjutnya (van Tonder et al., 2015).

Tambahan pula, penggunaan ujian MTT telah menjadi sebahagian daripada standard global dalam bidang toksikologi sel dan telah diintegrasikan dalam garis panduan ujian selular oleh banyak institusi penyelidikan serta industri farmaseutikal dan kosmetik. Oleh sebab itu, memahami prinsip asas dan aplikasi ujian ini bukan sahaja penting bagi penyelidik, tetapi juga memberi impak terhadap keselamatan pengguna dan pembangunan teknologi kesihatan moden.

Apa Itu Ujian MTT?

Ujian MTT, yang merupakan singkatan kepada 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, adalah sejenis ujian warna (colorimetric assay) yang telah lama digunakan dalam kajian biologi sel untuk mengukur kebolehhidupan dan keaktifan metabolik sel. Kaedah ini amat popular dalam penyelidikan makmal kerana ia memberikan gambaran kuantitatif tentang kesan sesuatu bahan terhadap sel hidup dengan cara yang mudah, murah, dan boleh diulang dengan ketepatan yang tinggi (Nga et al., 2020).

Prinsip asas ujian MTT bergantung kepada aktiviti enzim dalam mitokondria sel hidup. Dalam sel yang masih hidup dan aktif secara metabolik, enzim dehidrogenase akan menukar molekul MTT iaitu sejenis garam tetrazolium berwarna kuning pucat menjadi formazan, iaitu kristal berwarna ungu gelap yang tidak larut dalam air. Sebaliknya, sel yang telah mati atau tidak aktif secara metabolik tidak mampu menukar MTT kepada formazan, oleh itu tidak menghasilkan warna. Proses penukaran ini berlaku secara langsung dalam organel mitokondria, yang memainkan peranan penting dalam penghasilan tenaga sel (Grela et al., 2018).

Semakin banyak kristal formazan yang terbentuk, semakin tinggi jumlah sel hidup dalam sampel ujian tersebut. Selepas pembentukan kristal ini, pelarut seperti dimetil sulfoksida (DMSO) digunakan untuk melarutkan formazan bagi tujuan pengukuran optik. Kuantiti warna ungu yang terhasil kemudiannya dibaca menggunakan spektrofotometer mikroplat pada panjang gelombang sekitar 570 nm, dan nilai absorbans yang direkodkan mencerminkan tahap kelangsungan hidup sel dalam kehadiran bahan uji (van Tonder et al., 2015).

Disebabkan kebergantungannya kepada aktiviti metabolik sel, ujian MTT dianggap sebagai kaedah tidak langsung untuk mengukur kelangsungan hidup sel, namun ia tetap menjadi piawaian utama dalam pelbagai bidang termasuk toksikologi, farmakologi, dan pembangunan produk perubatan serta kosmetik. Ujian ini juga sering digunakan sebagai asas untuk menentukan kepekatan perencat separa (IC??) bagi ubat atau bahan aktif yang diuji, menjadikannya medium penting dalam penilaian keberkesanan dan ketoksikan sebatian.

Langkah-Langkah dalam Ujian MTT

Pelaksanaan ujian MTT melibatkan beberapa langkah utama yang perlu dilakukan dengan teliti dan dalam persekitaran makmal yang steril, untuk memastikan keputusan yang diambil adalah tepat dan boleh dipercayai. Langkah pertama ialah penyediaan sel, di mana sel-sel yang ingin diuji seperti sel kanser, sel fibroblas, atau sel kulit manusia dibiakkan dalam plat mikro (biasanya plat 96-lubang) dan dirawat dalam medium kultur sel di dalam inkubator yang dikawal suhu dan kepekatan karbon dioksida. Tujuan utamanya adalah untuk memastikan sel berada dalam keadaan optimum dan mencapai ketumpatan tertentu sebelum pendedahan kepada bahan uji dilakukan (Nga et al., 2020).

Setelah sel mencapai tahap pertumbuhan yang diinginkan, bahan ujian seperti ekstrak tumbuhan, ubat sintetik, dan sebatian semula jadi akan ditambah ke dalam setiap lubang (well) plat berkenaan pada kepekatan yang berbeza-beza. Tujuan langkah ini adalah untuk mengkaji bagaimana dos yang berlainan memberi kesan kepada kelangsungan hidup sel. Biasanya, dos diberikan dalam julat logaritma seperti 1, 10, 100, dan 1000 µg/mL bagi menghasilkan gambaran hubungan antara dos dan tindak balas sel (Nga et al., 2020).

Selepas tempoh inkubasi yang biasanya mengambil masa antara 24 hingga 72 jam, larutan MTT akan dimasukkan ke dalam setiap well. Larutan ini akan diserap oleh sel hidup dan ditukar oleh enzim mitokondria (dehidrogenase) menjadi kristal formazan berwarna ungu. Sebaliknya, sel yang telah mati atau rosak tidak dapat menjalankan proses ini, dan tidak akan mengubah warna kuning pucat molekul MTT menjadi formazan, iaitu kristal berwarna ungu gelap.

Seterusnya, reaksi dihentikan dengan membuang medium kultur dengan berhati-hati agar kristal formazan yang terbentuk tidak terganggu. Kristal ini kemudian dilarutkan menggunakan pelarut seperti dimetil sulfoksida (DMSO) atau isopropanol supaya larutan menjadi seragam dan mudah dibaca. Bacaan serapan (absorbance) diambil menggunakan spektrofotometer mikroplat, biasanya pada panjang gelombang sekitar 570 nm. 

Nilai absorbans yang diperoleh berkadar terus dengan jumlah sel yang masih hidup. Ini membolehkan para penyelidik menilai kesan bahan ujian secara kuantitatif. Data ini juga penting untuk mengira nilai seperti IC??, iaitu kepekatan bahan yang mampu mengurangkan viabiliti sel sebanyak 50%. Nilai ini sangat berguna dalam menilai keberkesanan dan keselamatan sesuatu sebatian ujian (Nga et al., 2020).

Kelebihan dan Kelemahan Ujian MTT

Ujian MTT merupakan salah satu kaedah standard dalam menilai kebolehhidupan sel kerana ia murah, mudah dijalankan, dan tidak memerlukan peralatan kompleks. Ia juga sangat sesuai untuk ujian berskala besar, terutamanya dengan penggunaan plat mikro seperti plat 96- atau 384-lubang, yang membolehkan ratusan sampel dianalisis serentak (van Tonder et al., 2015). Keputusan boleh diperoleh dalam masa 1 hingga 3 hari, menjadikannya kaedah pantas untuk penapisan awal bahan uji.

Namun begitu, ujian ini juga mempunyai kekangan. Ia tidak dapat membezakan jenis kematian sel, contohnya antara apoptosis (kematian sel terkawal) dan nekrosis (kematian akibat kerosakan), yang penting dalam kajian seperti kanser atau toksikologi. Selain itu, kehadiran bahan uji yang berwarna atau menyerap cahaya pada panjang gelombang yang sama dengan formazan (sekitar 570 nm) boleh menjejaskan ketepatan bacaan. Ujian ini juga bergantung pada aktiviti metabolik sel. Jadi, sel yang masih hidup tetapi kurang aktif mungkin memberikan bacaan yang rendah. Disebabkan itu, ujian MTT selalunya digabungkan dengan kaedah lain seperti ujian LDH, Annexin V, atau ATP untuk mendapatkan gambaran yang lebih lengkap mengenai kesan bahan terhadap sel.

Aplikasi Ujian MTT dalam Penyelidikan

Ujian MTT merupakan medium serbaguna yang digunakan secara meluas dalam pelbagai bidang penyelidikan bioperubatan, farmaseutikal, dan industri. Dalam penyelidikan kanser, ujian ini memainkan peranan penting dalam menilai keberkesanan ubat antikanser terhadap pelbagai jenis sel tumor. Penyelidik menggunakan ujian MTT untuk menentukan nilai IC??, iaitu kepekatan sesuatu bahan yang mampu membunuh 50% daripada populasi sel, sebagai petunjuk kepada potensi terapeutik sebatian tersebut. Selain itu, dalam pembangunan ubat dan suplemen, ujian MTT digunakan sebagai langkah penapisan awal untuk menilai keselamatan bahan sebelum ia diteruskan ke peringkat ujian haiwan atau klinikal. Proses ini penting untuk mengelakkan penggunaan bahan yang mungkin toksik dan merugikan dalam ujian lanjutan.

Dalam industri kosmetik pula, ujian MTT digunakan untuk memastikan bahawa produk penjagaan kulit seperti krim, losyen, dan serum adalah selamat dan tidak toksik terhadap sel kulit manusia. Ini selaras dengan keperluan piawaian keselamatan produk yang semakin ketat, terutamanya apabila kajian ke atas haiwan mula dikurangkan atas sebab etika. Di samping itu, ujian ini turut dimanfaatkan dalam bidang toksikologi alam sekitar, di mana para penyelidik menggunakan MTT untuk menilai kesan bahan pencemar atau sisa industri terhadap sel biologi. Ini membantu dalam penilaian risiko dan pemantauan impak bahan kimia terhadap alam sekitar dan kesihatan awam secara keseluruhan.

Kesimpulan: Pentingnya Ujian MTT dalam Inovasi Sains

Walaupun kelihatan seperti prosedur rutin makmal, ujian MTT sebenarnya memainkan peranan yang amat penting dalam landskap penyelidikan saintifik moden. Ia bukan sekadar alat untuk mengukur kebolehhidupan sel, tetapi juga merupakan titik permulaan kepada banyak inovasi penting dalam bidang bioperubatan dan bioteknologi. Keupayaannya untuk memberikan maklumat awal tentang ketoksikan dan keberkesanan sesuatu bahan menjadikannya medium saringan utama sebelum sebarang produk dibangunkan secara besar-besaran.

Dalam dunia yang semakin menekankan keselamatan dan keberkesanan produk, kefahaman terhadap kaedah ujian seperti MTT bukan sahaja penting untuk golongan penyelidik, tetapi juga untuk masyarakat umum yang semakin peka terhadap produk yang mereka gunakan. Oleh itu, ujian MTT kekal sebagai satu kaedah asas yang wajib ada di kebanyakan makmal penyelidikan, menyokong pembangunan ubat-ubatan, makanan tambahan, kosmetik dan pelbagai produk lain yang lebih selamat, berkesan dan bertanggungjawab dari segi saintifik.

Rujukan

Grela, E., Koz?owska, J., & Grabowiecka, A. (2018). Current methodology of MTT assay in bacteria – A review. Acta Histochemica, 120(4), 303–311. https://doi.org/10.1016/j.acthis.2018.03.007

Nga, N. T. H., Ngoc, T. T. B., Trinh, N. T. M., Thuoc, T. L., & Thao, D. T. P. (2020). Optimization and application of MTT assay in determining density of suspension cells. Analytical Biochemistry, 610(August), 113937. https://doi.org/10.1016/j.ab.2020.113937

van Tonder, A., Joubert, A. M., & Cromarty, A. D. (2015). Limitations of the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays. BMC Research Notes, 8, 47. https://doi.org/10.1186/s13104-015-1000-8